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1993年创刊,月刊发行
ISSN 1674-7968  CN 11-3342/S
主管单位:中华人民共和国教育部
主办单位:中国农业大学 中国农业生物技术学会
出版单位:中国农业大学 农业生物技术学报
主  编:武维华 院士
副主编 :陈化兰 林 敏 王海洋 李 奎 彭于发 徐正一 李 义 万建民 于嘉林
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农业生物技术学报  2017年 25卷 5期  刊出日期:2017-04-05
 
研究论文与报告
抗条锈病、耐盐小麦-十倍体长穗偃麦草5J(E)二体异附加系的分子细胞学鉴定
Molecular Cytogenetic Identification of Triticum aestivum-Thinopyrum ponticum 5J(E) Disomic Addition Line with Stripe Rust Resistance and Salt Tolerance
朱晨 王艳珍 陈春环 王长有 吉万全
2017, 25(5): 689-699  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (11236 KB)  ( 38 )
摘要
十倍体长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum)(2n=10x=70)是小麦(Triticum aestivum)重要的三级基因源,具有小麦改良所需要的多种优异性状。异附加系是将外源种属优异性状导入小麦背景中的重要种质资源。本研究利用形态学、细胞学、染色体组原位杂交(genomic in situ hybridization, GISH)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)和分子标记等技术对十倍体长穗偃麦草、普通小麦7182和87-1-9的后代衍生系CH1115-B15-1-5-1-1 (CH1115-B15)进行了鉴定,以期为该种质的应用提供理论依据。细胞学鉴定表明,CH1115-B15具有44条染色体,2n=44=22Ⅱ。GISH和FISH分析表明,44条染色体中有2条来源于十倍体长穗偃麦草的J(E)组染色体,其余42条染色体的FISH核型与普通小麦的FISH核型相同。SSR、表达序列标签技术(expressed sequence tags, EST)和PLUG (PCR based landmark unique gene)标记的分析表明,外源染色体是十倍体长穗偃麦草的第5部分同源群染色体。田间抗病性调查表明,CH1115-B15在成株期对条锈菌生理小种(Puccinia striiformis f. sp. tritici)条中32号和条中33号混合菌种表现为高抗(IT (infection type)=1)。芽期耐盐性鉴定表明,CH1115-B15的发芽率、根长、芽长与亲本和对照相比均有极显著差异(P<0.01),说明该种质具有较好的耐盐性。因此,CH1115-B15是一个抗条锈病、耐盐的小麦-十倍体长穗偃麦草5J(E)二体异附加系,这为抗条锈病、耐盐的小麦-十倍体长穗偃麦草异代换系和易位系的培育提供了重要的中间材料。
光唇鱼MSTN基因克隆、组织表达及SNP位点筛查
Cloning, Tissue Expression and SNP Screening of MSTN Gene in Acrossocheilus fasciatus
苗亮 李明云 潘娜 穆方申 侯红红 王礼闪 陈炯
2017, 25(5): 700-708  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (2910 KB)  ( 19 )
摘要
摘 要 肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)是骨骼肌生长的负调控因子,MSTN基因在遗传育种上有很大的潜在应用价值。光唇鱼(Acrossocheilus fasciatus)是一种具有较大开发前景的经济鱼类,但其生长速度较慢。为了解光唇鱼MSTN基因的特征并为生长性状标记辅助选择提供基础资料,本研究克隆了光唇鱼MSTN cDNA和基因组DNA序列、检测了组织表达情况并进行了单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点筛查。结果表明,光唇鱼MSTN cDNA序列全长2 163 bp,含有一个1 128 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF)、编码375个氨基酸,预测的编码蛋白具有脊椎动物MSTN的序列特征(如含有1个蛋白酶水解位点RIRR、C端有9个保守的半胱氨酸残基)。基于MSTN氨基酸序列的比对显示不同鱼类之间MSTN序列同源性较高(>80%),而鱼类与其他脊椎动物同源性较低(65%左右);光唇鱼与其他鲤科鱼类的MSTN基因高度同源(>96.5%)。系统进化树中鱼类聚为一枝、其他脊椎动物聚为另一枝,光唇鱼MSTN位于鲤科鱼类的小簇中。半定量RT-PCR检测显示,MSTN mRNA在光唇鱼脑和肌肉中高表达、肠和肝脏中有微弱表达、其他组织中均未见表达。光唇鱼MSTN基因的DNA序列全长5 828 bp,含有3个外显子和2个内含子,在第二内含子中检测到10个SNP位点,但与生长性状(体重、体长)不存在显著相关性(P>0.05)。研究结果为探究光唇鱼MSTN基因的功能和筛选生长性状相关辅助育种标记提供了参考资料。
玉米杂交种隆平206杂种优势的转录组分析
Transcriptome Analysis of Heterosis in Maize (Zea mays) Hybrid Longping206
徐志兰 韩坤龙 顾龙江 宋楠楠 王家宝 程备久 江海洋
2017, 25(5): 709-721  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (3065 KB)  ( 64 )
摘要
摘 要 玉米(Zea mays)杂交种隆平206是黄淮海地区推广的重要玉米品种,具有显著生长优势以及产量优势,为研究杂种优势提供了极好的材料。为了从分子生物学的角度解析隆平206相对于父母本(父本: L7221; 母本: L239)具有良好杂种优势的原因,本研究利用RNA-Seq技术,从转录组水平对其进行相关分析。结果表明,在杂交种与父母本之间共检测出3 005个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),其中1 788个基因在杂交子代中上调表达,925个下调表达。通过对这些差异基因进行基因本体(Gene Ontology, GO)分析和通路富集分析,发现5.88%差异表达的基因参与到碳代谢途径,8.24%的DEGs参与到植物信号转导途径,并且这些DEGs在杂交子代中的表达量显著升高。结果显示,碳代谢途径以及植物信号转导途径在隆平206杂种优势的形成过程中具有重要的意义。研究结果可以为后续研究玉米杂种优势的分子机制提供重要的数据支持。
利用VIGS 技术研究棉花GhPPO1基因的抗虫作用
Study on Insect Resistance of GhPPO1 Gene in Cotton (Gossypium arboretum) by VIGS Technique
程慧 张帅 雒珺瑜 荣伟 崔金杰 王登元
2017, 25(5): 722-728  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (1047 KB)  ( 28 )
摘要
摘 要 多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)是一类含铜的氧化还原酶,能够抵御植食性昆虫或病原菌的危害。为了研究棉花(Gossypium arboretum)中PPO1基因的抗虫作用,本研究利用病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS),构建基因沉默重组载体pTRV2-GhPPO1,转化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101,并侵染子叶展平的棉花植株;通过qRT-PCR检测沉默效果,并用获得的棉花植株饲喂二龄初期棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫,对沉默后棉花植株的抗虫性及GhPPO1基因表达量的变化进行检测。结果表明,利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)体系成功抑制了棉花GhPPO1的表达,沉默后GhPPO1基因相对表达量仅为对照组(空载体pTRV0)表达量的20%(P<0.05)。与饲喂正常棉花叶片的棉铃虫相比,饲喂GhPPO1基因沉默后棉花叶片的棉铃虫72 h后,体重增加86%,表明GhPPO1是棉花抗虫物质中的一类防御机制基因。棉铃虫直接诱导18、72 h的叶片中GhPPO1的表达量高于间接诱导叶片,证明沉默该基因后,消弱了棉花植株直接防御的能力,致使棉铃虫增重效果显著。由此推测该基因可能参与棉花直接防御反应。本研究对于GhPPO1在棉花防御植食性昆虫中的作用具有重要意义,为棉铃虫与棉花诱导防御之间的关系提供基础资料。
烟草中过表达丹参SAMDC基因增强其抗旱性
Overexpression of SAMDC Gene from Salvia miltiorrhiza Enhances Drought Tolerance in Transgenic Tobacco (Nicotiana tabacum)
刘玉 孙耿 仲昭辉 郑雪莲 邓科君
2017, 25(5): 729-738  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (6818 KB)  ( 46 )
摘要
摘 要 S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)是多胺合成代谢中的关键酶。本研究利用RT-PCR从丹参(Salvia miltiorrhiza)中获得了全长的SAMDC序列(GenBank No. GU983041.1),即SmSAMDC,与其他植物物种中的SAMDC氨基酸序列具有较高的同源性。为研究多胺在植物抗旱中的作用,利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘转化法将SmSAMDC导入到烟草(Nicotiana tabacum)中,得到稳定表达SmSAMDC的转基因的T0和T1代烟草,用以抗干旱分析。SmSAMDC在烟草中的异源表达明显地提高了转基因T0和T1代烟草的抗旱能力。生理研究发现,在干旱条件下,转SmSAMDC烟草具有更高的相对含水量(relative water content, RWC)和抗氧化酶活性;相对较低的丙二醛(malondialdehyde, MDA)和超氧阴离子自由基(O2·-)含量。并且,在干旱胁迫环境中,SmSAMDC在烟草的过表达显著地促进了转基因烟草中过氧化氢(H2O2)的积累。本研究证明过表达SmSAMDC能提高转基因烟草的抗旱能力,为SmSAMDC在其他物种的应用提供了理论依据。
杜梨IRT1基因的克隆及表达分析
Cloning and Expression Analysis of IRT1 Gene in Pyrus betulaefolia
金昕 刘娜 申长卫 谢昶琰 梅新兰 董彩霞 徐阳春
2017, 25(5): 739-749  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (9007 KB)  ( 60 )
摘要
摘 要 二价铁转运基因(iron-regulated transporter 1 gene, IRT1)是植物缺铁时主要的二价铁转运载体,参与植物铁营养吸收过程。为克隆杜梨(Pyrus betulaefolia) IRT1基因的全长序列并研究其序列及表达特征,本实验以杜梨幼苗为材料,采用反转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)、半定量PCR和RACE技术克隆到了杜梨二价铁转运蛋白IRT1基因的cDNA全长序列,命名为PbIRT1(GenBank登录号: KX355331)。生物信息学分析表明,该基因全长1 369 bp,含有一个1 095 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码364个氨基酸,蛋白序列含有9个跨膜结构,并含有一个完整的锌铁转运蛋白(ZRT/IRT-like protein, ZIP)家族结构域。氨基酸序列的同源关系分析表明,杜梨PbIRT1与小金海棠(Malus xiaojinensis) MxIRT1(GenBank登录号:AAO17059.1)、砀山酥梨(Py. bretschneideri) PbrIRT1(GenBank登录号:XP_009357272.1)蛋白序列的亲缘关系最近,聚为同一小枝。RT-PCR和qRT-PCR表达分析表明,PbIRT1基因在叶片和茎中几乎不表达,具有较强的根组织特异性;在根系中表达量随缺铁胁迫呈逐渐上调趋势,恢复供铁又抑制其表达,正常供铁处理的表达量不随时间变化。以上研究结果表明,杜梨PbIRT1基因的表达受到缺铁胁迫的诱导,可能参与了根系对二价铁的吸收和转运过程,该结果为进一步研究IRT1基因的功能及杜梨缺铁胁迫机制提供了理论依据。
绵羊RBP4基因克隆及其在不同月龄睾丸中的表达
Cloning of RBP4 Gene and Its Expression in Different Months Old Testis of Sheep (Ovis aires)
卢曾奎 高建峰 马友记 赵兴绪 张利平 喇永富
2017, 25(5): 750-757  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (5484 KB)  ( 38 )
摘要
摘 要 本研究旨在克隆绵羊(Ovis aires)视黄醇结合蛋白4 (retinol binding protein 4, RBP4)基因的CDS区序列,检测其在绵羊不同月龄睾丸组织中的表达水平,从而为研究RBP4基因在绵羊睾丸发育中的作用奠定基础。以绵羊睾丸为材料,采用RT-PCR技术克隆RBP4基因并用相关生物信息学软件预测RBP4蛋白的结构,采用qRT-PCR和免疫组织化学技术分别检测RBP4 mRNA和蛋白质的表达水平。结果显示,克隆得到绵羊RBP4基因CDS区长度为606 bp,编码201个氨基酸。绵羊RBP4核苷酸序列与山羊(Capra hircus)、牛(Bos taurus)、猪(Sus scrofa)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的相似性分别为97%、97%、95%、91%和85%。绵羊RBP4基因与山羊具有最近的亲缘关系,其次为牛、猪、人和小鼠。RBP4 mRNA在不同月龄绵羊睾丸中均有表达,表达量随月龄增加呈现出先降低后上升的趋势,相邻两组之间差异极显著(P<0.01)。RBP4蛋白主要表达于初级精母细胞、精子细胞、精子和生精小管,阳性反应积分光密度值随月龄增加呈现出先升高后降低的趋势,与绵羊睾丸RBP4 mRNA表达量相反。本研究结果表明,RBP4基因可能参与绵羊睾丸发育的调控,为进一步探讨RBP4在绵羊生殖过程中发挥的作用提供参考资料。
牦牛DGAT2基因intron5和intron6多态性及其对乳品质性状的影响
Polymorphism in the Intron5 and Intron6 of DGAT2 Gene and Its Association with Milk Quality Traits in Yak (Bos grunniens)
谢建鹏 石斌刚 胡江 罗玉柱 刘秀 高小莉 才让闹日 赵光平
2017, 25(5): 758-769  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (1608 KB)  ( 17 )
摘要
摘 要 乳脂是乳的重要组成部分,高乳脂率是牦牛(Bos grunniens)乳的主要特征。二酰基甘油酰基转移酶2(diacylglycerol acyltransferase 2, DGAT2)调控乳中甘油三酯(triacylglyceride,TRIG)合成,是乳脂肪性状的重要候选基因。本实验应用聚合酶链式反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)技术检测甘南牦牛、天祝白牦牛及大通牦牛DGAT2基因多态性,并分析基因突变对甘南牦牛乳品质性状影响。结果表明,三类群牦牛在DGAT2基因intron5区检测到A1、B1、C1 3种等位基因,存在c.613-214 A>G和c.613-337 C>A的SNPs;intron6区检测到A2、B2、C2 3种等位基因,存在c.787+616 G>A和c.787+691 T>G的SNPs;三类群牦牛DGAT2基因两区域均表现为中度多态,4个突变位点在群体中形成7种单倍型,各位点间存在连锁关系且接近于连锁平衡。甘南牦牛DGAT2基因intron5区突变影响乳脂率,第2胎携带等位基因B1的个体乳脂率显著高于未携带个体(P<0.05); intron6区突变影响乳脂率、乳蛋白率及总固体物质含量,携带等位基因A2的个体乳脂率、总固体物质含量较高且第2胎母牦牛显著高于未携带者(P<0.05),即选留携带等位基因A的个体有增加后代群体乳脂率及总固体物质含量的趋势;第2胎母牦牛基因型A2C2个体乳蛋白率最高,且A2C2、B2B2型个体显著高于其他基因型(P<0.05);单倍型H1H3个体的乳品质性状也高于其他单倍型。DGAT2基因intron5和intron6区突变可作为甘南牦牛乳品质性状潜在的遗传标记。本研究为牦牛乳品质性状候选基因分子遗传研究积累数据。
实验用SPF大白猪和长白猪SLA-1基因特征分析
Characterization Analysis of SLA-1 Gene from SPF Yorkshire (Sus scrofa) and Landrace
权金强 江新杰 李昌文 路小野 陈洪岩 赵生国 高彩霞
2017, 25(5): 770-780  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (3679 KB)  ( 35 )
摘要
摘 要 猪(Sus scrofa)白细胞抗原(swine leukocyte antigen, SLA)基因是引起异种移植细胞性免疫排斥的遗传因素之一。为丰富经典实验动物模型,解决异种器官移植模型缺乏问题,本研究采取实验用无特定病原体(specific pathogen free, SPF)大白猪和长白猪抗凝血,分离外周血淋巴细胞,提取总RNA,反转录cDNA,设计特异性引物进行PCR扩增测序,获得SLA-1基因,并进行特征分析。本研究共鉴定了16个SLA-1等位基因,各含有一个全长1 086 bp的完整开放阅读框,核苷酸多样度(nucleotide diversity, Pi)为0.045 59,单倍型多样度(haplotype diversity, Hd)为0.000 49,平均核苷酸差异数(average number of nucleotide differences, K)为49.508,G+C含量高达60.9%。150个核苷酸变异位点中简约信息位点(nucleotide parsimony informative sites, NPi)远高于单一多态位点(nucleotide singleton variable sites, NS);共编码361个氨基酸,产生82个突变,非同义突变(non-synonymous mutation sites, NSS)远高于同义突变(synonymous mutation sites, SS)。SLA-1等位基因多态性集中在第2和3外显子,33个关键氨基酸有9个保守位点,与人白细胞抗原-A(human leukocyte antigen-A, HLA-A)基因相同的位点有8个。HLA-A与β2-微球蛋白 (β2-microglobulin, β2m) 结合的19 个氨基酸中,11个氨基酸与SPF大白猪和长白猪保持一致;人(Homo sapiens)和SPF大白猪、长白猪CD8分子与主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)结合的关键氨基酸位点高度保守,只有225(Thr/Ser)和228(Thr/Met)位点不同。系统进化树表明,SPF大白猪和长白猪与Yucatan、韩国本地猪和梅山猪亲缘关系较近。本研究成功鉴定了16个SLA-1等位基因,高度多态,且SLA保留了HLA的部分功能位点。研究结果为构建动物模型以及相关的抗原递呈和免疫应答反应提供遗传学参考依据。
研究评述与展望
基因组编辑猪的研究现状及展望
Research Progress and Prospects of Genome Editing Pigs (Sus scrofa)
吴添文 齐传翔 李训碧 卢垚 李奎
2017, 25(5): 781-787  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (807 KB)  ( 32 )
摘要
摘 要 随着新的基因组编辑技术不断发展,具有优良性状的基因组编辑猪(Sus scrofa)及其产品大量涌现。国内外转基因猪(Sus scrofa)、基因组编辑猪的文献和专利检索结果表明,我国转基因猪、基因组编辑猪的研发水平均处世界领先地位。本文综述了国内外基因组编辑猪的研究进展,预测了未来基因组编辑猪的发展方向。鉴于世界各国转基因生物安全评价相关法规及对于基因组编辑生物的态度,提出对于我国基因组编辑动物及其产品安全管理的建议,以期促进基因组编辑动物及其产品的产业化应用。
模式植物侧芽和竹子笋芽分化发育的研究进展
Research Progress of Differentiation and Development of Model Plant Lateral Buds and Bamboo Shoot Bud
刘静 汤定钦 傅鹰 周明兵
2017, 25(5): 788-804  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (2158 KB)  ( 35 )
摘要
摘 要 植物侧芽的生长发育是植物形态建成中重要的部分,近来植物侧芽发育的研究有了很大的进展。本文以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)为重点,从激素和基因表达两个层面综述调控侧芽形成与生长的基因,并绘制了侧芽发育的调控网络。竹子(Bambusoideae)笋芽也是植物侧芽的一种,由于竹子笋芽分化发育与竹笋产量和竹材密切相关,近几年笋芽分化发育也取得一定成果,本文在模式植物侧芽生长发育研究的基础上对笋芽分化发育研究进行了归纳,并提出调控笋芽分化发育可能的关键候选基因,为下一步研究竹子笋芽分化发育分子机理指明可能的突破口。
研究资源与技术改进
低氮胁迫下高粱实时荧光定量PCR内参基因的筛选
Screening of Reference Genes for qRT-PCR Analysis in Sorghum (Sorghum bicolor) Under Low Nitrogen Stress
马建华 孙毅 王玉国 段永红
2017, 25(5): 805-812  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (2927 KB)  ( 12 )
摘要
摘 要 实时定量PCR技术广泛应用于植物功能基因转录水平变化的研究,选择适当的内参基因是获得准确分析结果的关键。氮元素的吸收和利用是影响高粱(Sorghum bicolor)产量的重要决定因素。本研究选取7个常用内参基因肌动蛋白基因(Actin)、多聚泛素酶基因(ubiqutin conjugating enzyme, UBQ)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、UBQ10、真核生物翻译起始因子2B(eukaryotic translation initiation factor 2B, EIF2B)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因家族(glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase, sbGAPDH)和真核生物翻译起始因子4a(eukaryotic translation initiation factor 4a, EIF4a)作为候选内参基因,以高粱根和叶为材料,筛选低氮胁迫下高粱实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)实验体系的最佳内参基因。经引物特异性检测,各候选内参基因引物均符合稳定性筛选要求。荧光定量PCR分析结果表明,7个候选内参基因的表达水平和稳定性因组织和氮处理的不同而呈现差异。叶片中GAPDH较其他内参基因表达丰度高;而在根系中UBQ10表达丰度最高。应用 GeNorm 软件程序对候选内参基因稳定性进行评价。结果表明,内参基因GAPDH和EIF4a在叶片中的表达稳定性最高,而根系中表达稳定度最高的为sbGAPDH和EIF4a。本研究结果为高粱中低氮胁迫相关差异基因的表达分析提供了基础资料,同时可为其他作物的同类研究提供参考。
应用猪冷冻精液进行卵子胞质单精子注射生产胚胎
Production of Porcine (Sus scrofa) Embryos by ICSI Using Frozen Thawed Semen
曹素英 李瑞岐 张少鹏 师丙波 魏晴晴 曹安 韩建永
2017, 25(5): 813-819  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (6565 KB)  ( 17 )
摘要
摘 要 近年来以猪(Sus scrofa)胚胎为材料的科学研究和动物生产快速发展,胚胎需求量增大,而猪胚胎、配子冷冻保存不成熟,体外受精胚胎发育率低,容易出现多精受精,因此需要建立一套快捷、高效的猪体外生产健康胚胎的技术体系。本研究集成并优化了猪精液冷冻、卵母细胞成熟和卵母细胞胞质单精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)技术,建立了一套体外高效生产猪胚胎的技术体系。首先建立了稳定的猪卵母细胞成熟体系,其孤雌激活胚胎卵裂率和囊胚发育率分别为79.51%和32.30%。然后利用新鲜精液和冷冻精液进行体外受精(in vitro fertilization, IVF),胚胎卵裂率分别为49.89% 和28.30%,囊胚发育率分别为31.44%和10.55%。利用新鲜精液进行IVF获得的胚胎卵裂率和囊胚发育率均明显高于冷冻精液(P<0.05)。进一步进行了ICSI实验,卵母细胞胞质注射冷冻精子单精子体外生产的猪胚胎卵裂率、囊胚发育率分别为83.00%和23.32%,而新鲜精液常规IVF受精卵卵裂率、囊胚发育率分别为49.89%和31.44%。ICSI胚胎囊胚发育率低于新鲜精液IVF受精卵和卵母细胞孤雌激活胚胎的囊胚发育率,但对于总体囊胚获得率,卵母细胞胞质注射冷冻精子体外生产猪胚胎明显高于新鲜精液IVF方法。研究工作为科研和生产所需猪健康胚胎提供了有效的、廉价的制备技术体系。
大菱鲆脑细胞系的建立
Establishment of a Brain Cell Line from Turbot (Scophthalmus maximus)
张念伟 刘肖峰 王娜 郭华 马佳璐 陈松林
2017, 25(5): 820-826  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (5452 KB)  ( 6 )
摘要
摘 要 鱼类细胞系作为一种重要的研究工具已经被广泛地应用于病毒学、环境毒理学、发育生物学以及生理学等研究中。大菱鲆(Scophthalmus maximus)作为一种重要的海水养殖鱼类,尚未见其脑细胞系建立的报道。本研究通过组织块法,以大菱鲆脑组织为材料,建立了大菱鲆脑细胞系(S. maximus brain cell line, SMB)。培养细胞系所用的培养基是在DMEM/F12基本培养基中添加了4-羟乙基哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, Hepes)、抗生素(青链霉素)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和β-巯基乙醇(2- mercaptoethanol, 2-ME)所配成的完全培养基。SMB细胞由上皮样细胞和成纤维样细胞构成,生长分裂旺盛,至今已传40余代。探究温度对其生长的影响,结果表明,SMB细胞在18~30 ℃均能正常生长,最适生长温度为24 ℃。核型分析显示,SMB细胞出现了染色体非整倍性,正常二倍体核型(2n=44t)约占43%。通过脂质体转染法成功的将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)报告基因转入SMB细胞中,并成功地获得了表达,转染率约为30%。该细胞系的建立将为大菱鲆致病性病毒的感染机制、基因功能分析等研究提供新的实验材料。
推广与应用
粉色茶用菊花品种‘中农夏妆’的选育
Breeding of Pink Colour Tea Cultivar of Chrysanthemum (Chrysanthemum morifolium) 'Zhongnong Xiazhuang'
李胜兰 马俊伟 樊晶艳 高俊平 洪波 徐彦杰
2017, 25(5): 827-832  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (5332 KB)  ( 18 )
摘要
摘 要 菊花(Chrysanthemum morifolium)栽培历史悠久,是兼具观赏和食用、药用的重要花卉。菊花茶外形轻美,具有清热、解毒、平肝明目等功效,现已成为人们休闲养生的首选茶品之一。‘中农夏妆’(C. morifolium 'Zhongnong Xiazhuang')是中国农业大学培育的适合庭院美化且可作为茶用的彩色茶用菊花品种。该品种以‘粉翎’(C. morifolium 'Fenling')(父本)和‘中农红袖’(C. morifolium 'Zhongnong Hongxiu')(母本)为亲本,采用常规杂交方法选育而成,其株型高大,花型优美,花色鲜艳,综合抗逆性较强,适合在我国大部分地区推广。本文介绍了茶用菊花品种‘中农夏妆’的选育过程、主要性状、栽培技术要点和应用价值。
专题:鹿茸生长发育与基因调控(一)
梅花鹿YWHAE基因编码区全长cDNA的克隆及序列分析
cDNA Coding Region Cloning and Sequence Analysing of Sika Deer (Cervus nippon) YWHAE Gene
刘慧 王桂武 王权威 赵志峰 魏鹳凝 杨万云 董振 刘振 杨雪雯 杨福合 李春义
2017, 25(5): 833-841  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (3561 KB)  ( 24 )
摘要
摘 要 YWHAEA (assignment of the human 14-3-3 epsilon isoform)基因编码14-3-3ε蛋白,此蛋白在发育的生茸区骨膜中特异性高表达。为了克隆梅花鹿(Cervus nippon) YWHAE基因编码区序列,预测其蛋白结构和功能,并研究其在梅花鹿发育过程中的表达特性。本研究以梅花鹿生茸区骨膜为材料,采用RT-PCR技术克隆梅花鹿YWHAE基因编码区序列,利用生物信息学手段预测其结构与功能。实验结果表明,梅花鹿YWHAE基因编码区全长768 bp (GenBank No. KY797653),编码255个氨基酸,氨基酸水平上与牛(Bos taurus)相似性高达99.6%;氨基酸序列分析表明,鹿YWHAE基因编码的14-3-3蛋白相对分子量为29 163.86 D,主要定位在细胞质内,属于水溶性蛋白;预测鹿14-3-3蛋白具有19个磷酸化位点、不存在糖基化位点;该蛋白的二级结构主要为螺旋结构,其三级结构呈现出递进螺旋状态。预测14-3-3蛋白的结构特点,本研究为探究14-3-3蛋白与其他蛋白的相互作用提供理论依据,同时为进一步研究鹿茸发育的调控机理提供基础依据。
Col X基因表达下调对鹿茸干细胞向软骨细胞分化的影响
Effects of Col X Gene Down Regulation on Differentiation of Antler Stem Cells into Chondrocytes (Cervus nippon)
褚文辉 张伟 付晶 李春义
2017, 25(5): 842-850  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (10453 KB)  ( 25 )
摘要
摘 要 X型胶原蛋白(collagen type X, Col X)是影响软骨内成骨的关键因子之一。为研究Col X在鹿茸软骨内成骨中的作用,本研究采用RNA技术(RNA interface, RNAi)下调鹿茸干细胞中Col X的表达并研究离体情况下Col X下调后鹿茸软骨内成骨的变化。首先,本研究采集了生茸区骨膜组织(antlerogenic periosteum, AP)并进行原代培养,同时利用间充质干细胞表面标记物(Stro-1)对AP细胞进行定性分析。其次,针对东北梅花鹿(Cervus nippon) Col X mRNA,设计了4对特异性的shRNA(S1~S4),并通过酶切连接法将其构建至慢病毒载体pLVTHM中。利用293T细胞包装慢病毒、收集浓缩病毒后利用悬液法感染AP细胞,同时利用微粒培养对其进行成软骨诱导。成软骨诱导培养21 d后,利用qRT-PCR和Western blot技术验证Col X的表达变化,最后通过组织切片结合HE染色和阿辛蓝染色鉴定成软骨过程变化。结果表明,本研究成功构建了包含shRNA(S1~S4)的pLVTHM载体,慢病毒包装成功且病毒滴度达到1×108 TU/mL。qRT-PCR和Western blot结果表明,4组shRNA均能显著下调微粒体中Col X的表达(P<0.05)。阿辛蓝染色发现,与阴性对照相比Col X下调后微粒体基质中阿辛蓝着色显著减少,说明基质中酸性粘多糖比例下降。同时,HE染色表明在粘多糖下降的同时伴随着部分软骨细胞的死亡表现为基质中无细胞陷窝空泡的增加。因此,综合判断Col X下调显著抑制或减缓微粒体成软骨过程,本研究为进一步研究Col X在哺乳动物软骨内成骨过程的作用提供理论依据。
利用qRT-PCR技术筛选鹿茸生长中心细胞与鹿茸干细胞内参基因
Reference Gene Selection for Antler Stem Cells and Antler Growth Center Cells for qRT-PCR
张伟 刘佳 董振 李春义
2017, 25(5): 851-860  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (6995 KB)  ( 18 )
摘要
摘 要 合适的内参基因是利用qRT-PCR准确分析基因相对表达量的先决条件。为了对鹿茸生长中心细胞和鹿茸干细胞间的差异表达基因进行准确定量分析,本研究筛选了TATA盒结合蛋白(TATA box binding protein, TBP)、β-肌动蛋白(actin beta, ACTB)、微管蛋白1α(tubulin alpha 1a, TUBA1A)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)及β2-微球蛋白(β2-microglobulin, B2M)这6个基因作为内参基因,利用qRT-PCR技术分别检测这些基因mRNA在鹿茸生长中心细胞及鹿茸干细胞中的表达情况,并对其表达的稳定性进行了综合评估。运用Delta-Ct method,geNorm(ver.3.5)、Bestkeeper(ver.1.0)和NormFinder(ver.0.953)和RefFinder软件综合分析表明,在鹿茸干细胞之间,ACTB和TUBA1A基因表达稳定性最高;在鹿茸生长中心细胞之间,B2M和ACTB基因表达稳定性最高;在所有鹿细胞系之间,B2M和ACTB基因表达稳定性最高。因此,B2M、ACTB以及TUBA1A候选基因可作为研究鹿茸生长中心细胞及鹿茸干细胞基因差异表达的内参基因,本研究为进一步研究鹿茸生长发育机制和开展鹿茸模型应用于生物医学研究提供了一定的理论依据。
 
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