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    期刊信息
1993年创刊,月刊发行
ISSN 1674-7968  CN 11-3342/S
主管单位:中华人民共和国教育部
主办单位:中国农业大学 中国农业生物技术学会
出版单位:中国农业大学 农业生物技术学报
主  编:武维华 院士
副主编 :陈化兰 林 敏 王海洋 李 奎 彭于发 徐正一 李 义 万建民 于嘉林
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农业生物技术学报  2017年 25卷 8期  刊出日期:2017-07-03
 
研究论文与报告
拟南芥DNA去甲基化候选突变体rll2的鉴定与功能分析
Identification and Functional Analysis of a Candidate Mutant rll2 Associated with DNA Demethylation Processes in Arabidopsis thaliana
杨柳 杨洁舒 孙睿聪 腊红桂
2017, 25(8): 1207-1216  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (6767 KB)  ( 3 )
摘要
摘 要 DNA甲基化是一种比较稳定的表观遗传修饰,已有的研究表明,DNA甲基化修饰对植物的生长、发育和逆境抗性等有至关重要的作用。目前对DNA甲基化产生过程的研究已经比较深入,但是对于DNA去甲基化机理的研究仍比较浅显。为了完善植物DNA去甲基化的分子机制,本研究以包含2×35S:LUC(luciferase)报告基因的拟南芥(Arabidopsis thaliana)转基因系Col-LUC为遗传筛选的起始亲本材料,将此亲本系进行甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate, EMS)诱变,从自交的M2代群体中筛选到了一株低荧光的突变体,命名为rll2 (reduced LUC luminescence 2),此突变对应的野生型基因因此被命名为RLL2。与高荧光的Col-LUC亲本系相比,rll2突变体荧光强度明显降低。在生长发育方面,rll2突变体表现出明显的发育缺陷, 如植株变矮、生长势明显比Col-LUC差。遗传学分析表明,rll2突变体携带一个细胞核单基因隐性突变。图位克隆结果表明,候选基因RLL2定位于5号染色体CL506-B14M1和CL507-B6M1两个分子标记之间,这两个分子标记分别位于F5O24和T6G21两个细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)克隆上。酶切-PCR(Chop-PCR)结果表明,rll2突变体中染色体上一些位点的DNA甲基化水平明显升高。反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)结果显示,rll2突变体中,RNA介导的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation, RdDM)途径的几个内源靶基因的表达有不同程度的降低。综上所述,本研究筛选到一株低荧光候选突变体rll2,并初步定位了RLL2基因;实验结果表明,其很可能参与了DNA去甲基化过程。这一研究为深入探索DNA去甲基化的分子机理提供了理论依据。
小白菜GAD基因克隆及高氮条件下外源GABA的诱导表达分析
Cloning of GAD Gene in Pakchoi (Brassica campestris ssp. chinensis) and Induced Expression Analysis Treated with Exogenous GABA Under Higher Nitrogen Level
李敬蕊 田真 吴晓蕾 张颖 宫彬彬 高洪波
2017, 25(8): 1217-1227  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (4420 KB)  ( 3 )
摘要
摘 要 谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)是生物体内普遍存在的一类胞内酶,主要分布于细胞质中,是催化谷氨酸脱羧反应的关键限速酶,产物γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)具有调节植物生长发育、抵抗非生物胁迫等功能。本研究以小白菜‘五月慢’(Brassica campestris ssp. chinensis)为材料,采用同源序列法克隆了小白菜谷氨酸脱羧酶基因(glutamic acid decarboxylase gene, GAD) (GenBank登录号为KP852557);采用浸种和外源添加处理,检测了高氮水平下外源GABA对小白菜生长、GAD基因和酶蛋白表达及酶活性的影响。结果表明,小白菜GAD含有一个长为1 485 bp的开放阅读框,编码494个氨基酸,蛋白保守结构域包含一个磷酸吡哆醛依赖的谷草转氨酶超家族;小白菜GAD基因编码的氨基酸序列与大白菜(B. rapa) GAD2基因氨基酸序列的一致性达到100%,与甘蓝型油菜(B. napus)、萝卜 (Raphanus sativus)和芥菜(B. juncea)的GAD2基因氨基酸序列亲缘关系较近,序列一致性分别为99%、99%和98%。外源GABA添加和浸种均提高了高氮水平下小白菜的生长以及叶片GAD基因转录水平、GAD蛋白表达量和GAD酶的活性,但GABA处理间存在着明显的浓度差异,其中3.75~6.25 mmol/L GABA浸种与2.5~3.75 mmol/L添加处理效果较明显(P<0.05)。实验结果初步证实了小白菜的生长、GAD基因、蛋白和活性受GABA施用浓度和施用方式的影响,且与根际环境氮素水平密切相关。该研究为进一步利用BcGAD基因和GABA调控方法提高叶菜类蔬菜品质提供理论依据。
抑制StOSM-3b表达对马铃薯表型的影响
Effect of Inhibition of StOSM-3b Expression on Phenotypy in Potato(Solanum tuberosum)
乔丽媛 乔玲波 张晓萍 杨丽坤 郑蕊 姚新灵
2017, 25(8): 1228-1234  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (3746 KB)  ( 3 )
摘要
摘 要 渗调蛋白(osmotin, OSM)是植物中普遍存在的多功能蛋白,研究已明确OSM是胁迫响应蛋白,由参与胁迫响应的功能推测,OSM通过参与生长发育,调控植物对胁迫的响应,但OSM参与生长发育的研究报道极为有限。本研究在分离了马铃薯(Solanum tuberosum) StOSM-3b基因cDNA的基础上,用pCambia1305-35S载体,通过基因工程技术,构建了抑制渗调蛋白表达的反义StOSM-3b基因cDNA载体,农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导途径转化反义StOSM-3b至马铃薯体内,筛选获得β-葡萄糖苷酸酶(β- glucuronidase, GUS)染色阳性转化株系,阳性株系叶片StOSM-3b mRNA积累和渗调蛋白酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)定量数据分析显示,抑制株系叶片StOSM-3b mRNA积累是对照的25%,渗调蛋白含量是对照株系的52%,这表明反义StOSM-3b部分抑制了StOSM-3b表达,下调了马铃薯渗调蛋白的体内积累;下调渗调蛋白表达株系表现为生长缓慢、个体矮小、且生育期显著缩短、不能正常结薯的表型,且生长节奏失调。该研究结果为渗调蛋白参与生长和发育过程提供了直接证据。
干旱和NaCl胁迫下木薯GB含量及BADH基因的表达
GB Content and Expression of BADH Genes in Cassava (Manihot esculenta) Under Drought and NaCl Stress
任梦云 冯仁军 关潇 史后蕊 云天艳 张银东
2017, 25(8): 1235-1244  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (3110 KB)  ( 3 )
摘要
摘 要 甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase, BADH)是甜菜碱(glycine betaine, GB)合成过程中的关键酶。为检测BADH基因在木薯(Manihot esculenta)不同组织中的表达差异,探究干旱与NaCl胁迫下其表达谱变化规律,本研究利用生物信息学方法分析和鉴定木薯BADH基因,定位MeBADHs在染色体上的位置以及确定5'端上游序列顺式作用元件;采用qRT-PCR测定BADH基因在木薯品种SC5根、块根、茎和叶中的表达差异,同时检测在PEG-6000模拟脱水胁迫、NaCl胁迫及自然干旱胁迫下MeBADHs基因的转录水平变化,采用相关试剂盒测定木薯中GB含量的变化。结果显示,MeBADHs两个基因在各组织之中均有表达,在块根中表达量显著高于根(P<0.05)。PEG-6000模拟干旱条件下,与0 h相比,1~2 h时MeBADH1和MeBADH2在叶、茎、根以及块根中的表达量变化不大;NaCl处理条件下,叶中MeBADH1在8 h表达量极显著高于0 h (P<0.01),而MeBADH2则在不同处理时间下的表达量水平相差不大,在茎和根中,MeBADHs在处理发生1 h时表达量水平极显著高于0 h (P<0.01);自然缺水干旱条件下,茎和根中MeBADH1和MeBADH2分别在6和18 d时的表达量极显著高于0 d (P<0.01)。PEG-6000处理下,GB含量出现了波动并呈现略增趋势;NaCl处理条件下GB含量在前期表达较稳定,8 h时剧烈响应,即出现下调趋势,24 h时GB含量显著低于0 h (P<0.05)。在自然干旱胁迫下,GB含量逐渐呈现上调趋势,并在9和15 d达到高峰,显著高于0 d (P<0.05)。研究结果为进一步研究木薯分子抗旱机制及新品种的选育提供了理论依据。
小麦棉子糖合成酶基因(TaRS)的克隆及特性分析
Cloning and Characterization Analysis of Raffinose Synthase Gene (TaRS) in Wheat (Triticum aestivum)
乔梦 田原 杨瑞 付金梅 康妮 闵东红 张小红
2017, 25(8): 1245-1254  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (5144 KB)  ( 4 )
摘要
摘 要 棉子糖(raffinose)作为一种重要的可溶性碳水化合物广泛存在于高等植物中,并且参与植物抵抗各种非生物逆境胁迫。棉子糖合成酶(raffinose synthase, RS, EC2.4.1.82)是催化肌醇半乳糖苷和蔗糖产生棉子糖的关键酶。本研究通过同源比对克隆到了一个小麦(Triticum aestivum)的棉子糖合成酶基因(triticum aestivum raffinose synthse, TaRS),该基因定位于小麦3B染色体上。序列分析显示,TaRS基因具有一个完整的开放阅读框(2 349 bp),包含两个保守模体,即KxD和RxxxD,属于糖苷水解酶超家族GH-D (glycoside hydrolases, clan D)。在进化关系上,小麦TaRS蛋白与山羊草(Aegilops tauschii)的棉子糖合成酶XM020298559.1亲缘关系最近(相似度为98.47%)。Southern 杂交结果表明,TaRS基因在中国春小麦基因组中存在至少4个拷贝。亚细胞定位结果显示,TaRS蛋白定位在小麦叶肉细胞的细胞膜上。对该基因进行组织表达特异性分析发现,TaRS在小麦的根、茎、叶和种子中都有表达,但在叶片中的表达量最高。将TaRS在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行异源表达,通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)法检测发现,TaRS能够以蔗糖和肌醇半乳糖苷为底物在体外合成棉子糖,并且反应的最适pH在8.0左右。此外,TaRS的表达受到脱水、42 ℃高温、高盐和4 ℃低温4种胁迫的诱导,分别于胁迫12、1、1和48 h时表达量达到最大。本研究为进一步利用TaRS基因进行小麦抗逆育种提供了理论依据。
农杆菌介导的耐盐多基因转化紫花苜蓿及分子检测
Alfalfa (Medicago sativa) Transformation with Salt-tolerant Muti-Gene Mediated by Agrobacterium tumefaciens and Molecular Identification
王静 麻冬梅 许兴
2017, 25(8): 1255-1264  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (5505 KB)  ( 4 )
摘要
摘 要 盐超敏感(salt overly sensitive, SOS)信号转导途径是一个控制离子平衡的信号通路,可以在细胞水平上排出Na+控制离子平衡,从而提高植物的耐盐性。将多基因植物表达载体pSOS中包含的SOS1、SOS2和SOS3、SOS3类钙结合蛋白8/钙调磷酸酶B10 (SOS3-like calcium binding protein 8/calcineurin B-like 10, SCaBP8/CBL10)及抗双丙氨膦(bialaphos resistance, Bar)基因多个耐盐基因转化苜蓿(Medicago sativa),对于增强苜蓿的耐盐性具有重要的现实意义。本研究采用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法,以“金皇后”苜蓿的子叶节为外植体进行遗传转化,除草剂草丁膦(glufosinate)最佳筛选浓度确定为0.6 mg/L,除菌剂头孢霉素(cefotazime)筛选浓度确定为300 mg/L,经除草剂筛选共获得了25株独立来源的转化植株。经PCR分子检测,有6株转基因植株具有PCR电泳扩增条带,阳性率为24%。随机将4株阳性植株进行Southern杂交,有3株出现杂交信号,拷贝数为1~2个。RT-PCR检测表明,与预期的条带大小相符合的Bar基因(463 bp)和SOS1基因(700 bp)在转基因植株中表达。结果表明,多个外源目的基因已经整合到苜蓿基因组中并且在转录水平上已表达。250 mmol/L NaCl胁迫处理后,转基因和野生型植株生长都受到了一定程度上的抑制,但转基因植株的株高均明显高于野生型,P1和P2株系叶面积均明显高于野生型对照,3个株系的鲜重均明显高于对照,P2和P4株系叶绿素含量明显高于野生型对照。说明SOS途径多基因的超表达提高了转基因苜蓿的耐盐性。本研究成功获得了转耐盐多基因苜蓿,为选育适合盐渍化土壤种植的耐盐苜蓿新品种,及苜蓿耐盐鉴定和耐盐机理等研究提供了理论依据。
Prd29A与CaMV 35S启动子调控转胡萝卜AFP基因提高烟草抗寒性
Enhanced Cold Tolerance of Tobacco (Nicotiana tabacum) Transformed with Carrot (Daucus carota) AFP Gene Driven by Prd29A and CaMV 35S Promoter
王梦阳 魏宪辉 王金菁 刘海洋 佘露露 陈玉珍 卢存福
2017, 25(8): 1265-1277  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (4837 KB)  ( 11 )
摘要
摘 要 抗冻蛋白(antifreeze proteins, AFPs)是耐寒生物为适应冷环境而产生的特殊小分子蛋白质,具有降低冰点、抑制重结晶的作用。本实验研究了在环境诱导型启动子(Prd29A(responsive to desiccation 29A))和组成型启动子(花椰菜花叶病毒35S(Cauliflower mosaic virus 35S, CaMV 35S))驱动下胡萝卜(Daucus carota) AFP在烟草(Nicotiana tabacum)中的表达。结果表明,DcAFP基因已整合到烟草基因组中且可以稳定遗传,T1转基因烟草花序发育不良,蒴果容易从果柄基部脱落,极少数果实能够正常发育;4 ℃低温驯化10 d,-1 ℃处理24 h,室温恢复生长1周,T1代转Prd29A:DcAFP基因烟草存活率比转CaMV35S:DcAFP基因烟草高34.6%,比野生型烟草高61.1%,且长势良好,而野生型烟草大多数枯萎死亡;低温胁迫处理导致所有烟草叶绿素荧光参数Fv/Fm均有所降低,但25 ℃恢复生长后,转Prd29A:DcAFP基因烟草Fv/Fm接近正常水平,而转CaMV35S:DcAFP基因烟草Fv/Fm仅比野生型略高;与野生型对比,两种不同启动子驱动的转DcAFP基因烟草在4 ℃低温驯化(0~15 d)期间积累了较多的脯氨酸、可溶性蛋白及可溶性糖等渗透调节物质,抗氧化酶(超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化物酶(peroxidase, POD))酶活有所提高,同工酶谱带增多;特别是转Prd29A:DcAFP基因烟草比转CaMV35S:DcAFP基因烟草中脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、SOD酶活酶活及POD酶活分别增加 45.1%、12.1%、20%、19.7%、8.6%,而且转入Prd29A启动子驱动的DcAFP基因可以更有效的提高转基因烟草的抗寒性,并且其对转基因烟草生长发育影响相对较小。研究结果对于抗冻转基因植物的培育具有重要参考价值。
Zera标签蛋白微粒在本氏烟中的表达及纯化
Expression and Purification of Zera Tag-induced Microparticles in Nicotiana benthamiana
李志英 徐丽 吴乐乐 丁向真 王盛
2017, 25(8): 1278-1288  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (7718 KB)  ( 2 )
摘要
摘 要 Zera标签融合蛋白可以在植物叶片细胞中表达并形成蛋白质微粒且形成的微粒可以激发受体动物的免疫反应,推测Zera标签作为亚单位蛋白疫苗生物载体具有一定的可行性和潜力。为了验证这一假说,采用基因体外合成技术和亚克隆技术,构建植物二元表达载体pJ Zera-GFP,以农杆菌浸润法(Agroinfiltration)接种受体植物本氏烟(Nicotiana benthamiana)。通过对Zera标签融合的报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)的荧光观察,并辅以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和Western blot测定,对Zera标签融合蛋白微粒在植物中的表达情况和表达产物的特点进行了观察和分析,并初步建立起了相关的简易分离纯化技术。受体农杆菌菌株的比较结果表明,EHA105比GV3101更适合作为pJ Zera-GFP载体的农杆菌浸润法宿主菌株。同时发现,Zera-GFP融合蛋白以蛋白质微粒团块的形式存在于宿主细胞中,且对本氏烟细胞没有明显的细胞毒性。进一步观察烟草叶片细胞中Zera-GFP蛋白微粒的形态特征发现,叶片细胞中的微粒团块是由大小不均一、边缘轮廓清晰的近圆形小球组成。小球微粒直径范围为0.5~2.5 μm之间,球体彼此靠近,紧密的聚集在一起。从Zera标签形成微粒的粒径大小、表面形态、均匀程度和抗原含量等因素分析,认为表达的微粒具有成为亚单位疫苗生物载体的潜力。采用蔗糖密度梯度离心和垫层离心对Zera-GFP微粒进行了初步的纯化。实验结果显示,两种离心技术均可以从接种后的烟草叶片中纯化获得大量的Zera-GFP蛋白微粒,60%蔗糖垫层相对更适合作为Zera标签蛋白微粒的初步纯化技术。同时根据相关研究结果推测,Zera标签蛋白微粒在受体植物细胞内的形成过程是一个从可溶到聚集的动态演变过程。研究结果为基于Zera标签的新型微粒疫苗的研究奠定了理论和实践基础。
桂花扩展蛋白基因家族的鉴定和表达分析
Identification and Expression Analysis of Expansin Gene Family in Osmanthus fragrans
罗云 张超 付建新 董彬 胡绍庆 赵宏波
2017, 25(8): 1289-1299  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (1256 KB)  ( 2 )
摘要
摘 要 扩展蛋白(expansin, EXP)是一类引起植物细胞壁松弛的蛋白质,在花开放过程花瓣细胞扩展中发挥重要作用。为了探究桂花(Osmanthus fragrans)中扩展蛋白基因在花开放中的表达特征,本研究从已构建的桂花品种‘堰虹桂’花芽转录组数据库中筛选得到12个与植物EXP基因同源性较高的Unigene序列,以盛开期花瓣为材料克隆得到其cDNA序列。通过NCBI 数据库中的比对结果,将12个Unigene序列分别命名为OfEXPA1 ~OfEXPA8,OfEXPB1~OfEXPB2,OfEXLA1,OfEXLB1(GenBank登录号: KY968700~KY968711)。BLASTX查找比对结合ORF Finder工具分析发现,除了OfEXPA1、OfEXPA5和OfEXLB1基因的cDNA序列5′ 端有少量缺失外,另外9个EXP基因具有cDNA全长序列。序列分析结果表明,9个全长cDNA推导的蛋白氨基酸残基数为240~274个,预测的分子量为26.06~29.7 kD,理论等电点为4.77~9.74。桂花OfEXPA1~OfEXPA8和OfEXPB1~OfEXPB2蛋白具有典型的扩展蛋白结构特征,N端含有8个保守的半胱氨酸结构域,C端含有4个保守的色氨酸结构域,其中大部分EXPA和EXPB蛋白含有组氨酸功能域HFD基序序列。OfEXLA1具有特征基序CDQC,OfEXLB1特征基序尚未见报道。qRT-PCR分析结果发现桂花12个EXP基因在‘堰虹桂’花芽不同发育过程中均有表达,其中OfEXPA1、OfEXPA3、OfEXPA5、OfEXPA6、OfEXPA7、OfEXPA8、OfEXPB1、OfEXPB2和OfEXLB1整体表达模式较为类似,花芽发育前期(B1~B6)表达量显著高于花瓣扩展期(B7~FF),在花瓣扩展期表达量逐渐下降;而OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1在花芽发育前期表达量较低,而随着花瓣显著伸展表达量急剧增加,在花瓣扩展期呈现较高的表达。结合系统进化树分析发现OfEXPA4和OfEXPA2分别与唐菖蒲(Gladiolus grandiflorus) GgEXPA1和月季(Rosa chinensis) RhEXPA1亲缘关系较近,且OfEXPA2和OfEXPA4这两个基因与GgEXPA1和RhEXPA1基因的表达模式相似,推测这2个基因为花开放过程中的关键EXP基因家族成员;进一步根据OfEXLA1表达特征推测其亦参与调控桂花花开放。研究结果为全面理解桂花花开放机制、扩展蛋白基因功能提供理论依据。
贵州地方山羊ERα多态性及组织差异表达
Polymorphism and Tissue Differential Expression of ERα gene in Guizhou Goats (Capra hicus)
李鹏程 孙振梅 许厚强 陈祥
2017, 25(8): 1300-1306  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF   (0 KB)  ( 2 )
摘要
摘 要 雌激素受体α(estrogen receptor, ERα)基因在动物繁殖过程中起着重要作用,已经被认为是影响猪(Sus scrofa)产仔数的主效基因,但在山羊(Capra hicus)方面研究较少。为了揭示雌激素受体基因对贵州本地山羊繁殖性状的影响,本研究采用直接测序技术检测了该基因8个外显子的SNP,并使用qRT-PCR检测ERα基因在黔北麻羊的下丘脑,垂体,性腺轴中不同表达量。结果表明,ERα基因在黔北麻羊和贵州黑山羊第8外显子中均存在C127T突变,且属于错义突变,致使该基因mRNA二级结构以及编码蛋白结构的改变。在第8外显子的C127T位点发现CC、CT和TT 3种基因型,其中,在黔北麻羊群体中CC基因型个体的产羔数与TT和CT基因型间达差异显著水平(P<0.05),在贵州黑山羊群体中未达到显著差异。qRT-PCR检测结果显示,单羔组和多羔组黔北麻羊的5个组织中ERα基因均有表达,且卵巢均最高。进一步研究发现,单羔组和多羔组黔北麻羊卵巢组织中的ERα mRNA表达量差异显著(P<0.05),而在其他组织间均未达到差异显著(P>0.05)。结果显示,ERα中的C127T突变可能影响贵州地方山羊的产羔数,为培育贵州地方山羊高繁殖力品系提供了理论依据。
豚鼠腹腔巨噬细胞的分离培养及免疫抗结核功能检测
Isolation and Cultivation of Guinea Pig (Cavia porcellus) Peritoneal Macrophage and Its Immunological Function in Response to Tuberculosis
李欧阳 洪丹萍 柯敏霞 麦丽丽 沈文强 何玉龙 刘立丽 吴月红
2017, 25(8): 1307-1313  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (3572 KB)  ( 3 )
摘要
摘 要 巨噬细胞(macrophages, Mφ)在机体正常发育、体内平衡、组织修复和对病原体的免疫反应中起着重要作用。为了研究豚鼠(Cavia porcellus) Mφ在结核免疫中的作用及机制,本研究通过淀粉肉汤溶液预刺激的方法分离培养了豚鼠腹腔Mφ,并进行了细胞形态学观察、细胞活力、吞噬功能、非特异性酯酶染色和细胞表面特异性抗原表达检测等一系列鉴定。在此基础上,利用结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)感染分离培养的Mφ,并分析BCG对Mφ NO的产生和细胞凋亡的影响。结果表明,分离培养的腹腔Mφ具有Mφ所特有的形态特征、较强细胞活力和吞噬能力,并可检测到特异性的白细胞分化抗原14(cluster of differentiation 14, CD14)、CD40和CD68等的表达。与未感染的对照组相比,BCG感染24 h后Mφ产生的NO极显著增加(P<0.01),细胞的凋亡率也极显著升高(P<0.01)。表明淀粉肉汤溶液刺激的方法可成功获取豚鼠腹腔Mφ,同时证实BCG感染后能诱导其产生的NO增多,并且细胞凋亡率增加,提示其可能在抗结核免疫中起重要作用。研究结果为MTB和Mφ相互作用研究提供细胞模型和数据支撑。
MiR-26a靶向调节PTEN对3T3-L1前脂肪细胞分化的促进效应
MiR-26a Promoting 3t3-l1 Adipocyte Differentiation via Targeting Regulatory PTEN
宁椿游 李贵林 杨羽晨 马瑶 李明洲 刘海峰
2017, 25(8): 1314-1325  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (7386 KB)  ( 2 )
摘要
摘 要 miRNA作为内源性非编码小RNA,主要在转录后水平调控基因表达。近年来越来越多的证据表明,miRNA通过调控脂肪细胞分化相关的转录因子和信号通路来影响脂肪细胞的分化。为探究miR-26a对小鼠(Mus musculus)3T3-L1前脂肪细胞分化的影响及具体的调节作用,本研究分别用miR-26a的agomir和antagomir对miR-26a进行过表达和敲除。结果显示,miR-26a的表达量在3T3-L1细胞分化过程中逐渐上升。过表达miR-26a极显著增加了脂肪合成相关基因——过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FAS)和脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase, LPL)的mRNA水平(P<0.01),PPARγ和FAS的蛋白水平也显著升高(P<0.05)。同时,细胞内的脂质聚集也明显增加。相反,抑制miR-26a的表达量降低了3T3-L1细胞的分化。通过靶基因预测和双荧光素酶报告系统分析,证明miR-26a能直接结合到同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog, PTEN) mRNA的3' UTR,并且导致其miRNA和蛋白水平降低(P<0.05)。本研究的结果表明,miR-26a可能通过直接抑制PTEN来正向的调节3T3-L1细胞的脂肪分化,该结果为miRNA成为治疗肥胖相关疾病的药物靶分子提供了一定的理论依据。
鳙低氧胁迫差异表达基因的cDNA-AFLP分析
cDNA-AFLP Analysis of Differentially Expressed Genes Related to Hypoxia Stress in Bighead Carp (Hypophthalmichthys nobilis)
刘雪丽 王新华 俞小牧 庞美霞 童金苟
2017, 25(8): 1326-1335  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (5673 KB)  ( 2 )
摘要
摘 要 低氧是水产养殖动物面临的主要胁迫之一。鳙(Hypophthalmichthys nobilis)是我国最重要的淡水养殖鱼类之一,其对低氧胁迫敏感,但相关的遗传基础研究报道很少。本研究利用cDNA-扩增片段长度多态性(cDNA-amplified fragment length polymorphism, cDNA-AFLP)技术对低氧敏感和低氧耐受两组鱼进行比较分析,鉴定鳙与低氧反应相关的信号通路中的差异表达基因。从EcoRⅠ和MseⅠAFLP体系的256个引物组合共获得10 571条转录衍生片段(transcript-derived fragments, TDFs)。其中,低氧胁迫后差异表达的TDFs数目为221个,包括上调表达137个(62%),下调表达84个(38%)。对70个差异TDFs成功地进行了切胶回收、PCR产物克隆和测序,序列比对分析后发现:29个TDFs在数据库中未检索到同源序列;9个TDFs比对到未知功能序列;32个TDFs比对到已知生物学功能的序列,其功能包括转录调控、应激和信号转导、能量代谢、蛋白质合成、免疫防御以及细胞生长与增殖。随机选取4个已知功能的TDFs(ANXA6、TRIM25、Tnp和RBAT)进行qRT-PCR验证,结果显示:ANXA6、TRIM25和Tnp在低氧胁迫后的表达模式与AFLP分析结果一致,RBAT与AFLP结果不一致。本研究结果有助于揭示鳙应对低氧逆境的生理和遗传调控机制,同时对鳙抗逆品种的分子标记辅助选育也有一定的参考价值。
不同年份陈年普洱茶中芽胞杆菌的多样性
Diversity of the Bacillus-like Species in the Different Year-old Fermented Pu-erh Tea
葛慈斌 刘波 陈梅春 朱育菁 刘国红 王阶平
2017, 25(8): 1336-1348  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (3645 KB)  ( 3 )
摘要
摘 要 微生物的发酵作用对普洱茶品质、特色的形成起着决定性的影响,其中芽胞杆菌(Bacillus-like species)又是普洱茶发酵后期的优势微生物类群。为了解陈年普洱茶中芽胞杆菌的存在状况,采用稀释平板法,对以云南省一定区域内特有的云南大叶种(Camellia sinensis)晒青毛茶为原料制成的龙马同庆号、大有庆和钧义祥等16个不同生产年份的陈年普洱茶样品进行芽胞杆菌分离,并用16S rRNA基因序列测定的方法对分离到的芽胞杆菌进行初步鉴定。结果分离出芽胞杆菌153株,鉴定为8个属、36个种,其中芽胞杆菌属(Bacillus)的种最多,有20种、87株,赖氨酸芽胞杆菌属(Lysinibacillus)、短芽胞杆菌属(Brevibacillus)分别有6种、20株和4种、20株;其他5个属分别为虚构芽胞杆菌属(Fictibacillus)、大洋芽胞杆菌属(Oceanobacillus)、鸟氨酸芽胞杆菌属(Ornithinibacillus)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus)和枝芽胞杆菌属(Virgibacillus);虚构芽胞杆菌属、鸟氨酸芽胞杆菌属的菌株为首次报道从普洱茶中分离到。不同普洱茶样品中分离到的芽胞杆菌种类、数量存在差异,中茶(红印绿字)中分离到的芽胞杆菌菌株数及数量最多、分别为19株和3.76×105 cfu/g,文革茶庄(红旗公社)分离到的芽胞杆菌种数最多、有12种,敬昌号中的芽胞杆菌数量最少,只有7.62×103 cfu/g。不同的芽胞杆菌,在这16个茶样中的分布状况存在差别,蜡样芽胞杆菌(Ba. cereus)、沙氏芽胞杆菌(Ba. shackletonii)是普洱茶中分布最广的芽胞杆菌,在9个样品中均有存在;蔬菜芽胞杆菌(Ba. oleronius)其次,在8个样品中存在。同一种芽胞杆菌,在不同的茶样中的数量不一样;不同的芽胞杆菌,在同一茶样中的数量也存在差别。研究结果表明,陈年普洱茶中存在种类较多、数量较大的芽胞杆菌,但不同普洱茶中的芽胞杆菌种类、数量存在差别。本研究结果可为探索芽胞杆菌对普洱茶特征形成的作用机制以及陈年普洱茶中芽胞杆菌类群与其保健功能之间的关系提供材料及理论基础。
鸡IL-4在杆状病毒表达系统中的表达及其生物学活性分析
Expression of Chicken (Gallus gallus) IL-4 in Baculovirus Vector System and Its Bioactivity Analysis
戴华 陈俊华 徐正中 焦新安
2017, 25(8): 1349-1355  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (1602 KB)  ( 2 )
摘要
摘 要 鸡(Gallus gallus)白细胞介素4(interleukin-4, IL-4)是家禽2型辅助性T细胞(type 2 T helper, Th2)免疫应答的重要指示分子,对家禽免疫应答、免疫功能分析具有重要作用,由于缺乏有效的检测工具,关于鸡IL-4(ChIL-4)的研究目前较滞后。为制备具有生物学活性的重组ChIL-4,本研究采用分子生物学技术,从实验室前期构建的重组质粒pVAX1-ChIL-4中双酶切获得ChIL-4基因片段,并将其克隆入杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1,构建重组质粒pFast-ChIL-4,通过位点特异性转座,将ChIL-4基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建重组质粒pBac-ChIL-4并转染草地贪夜蛾细胞系9(Spodoptera frugiperda, Sf9),进行蛋白表达;采用间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence, IFA)、间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)对重组ChIL-4(Bac-ChIL-4)的表达进行分析;采用鸡脾脏淋巴细胞增殖实验对重组蛋白的生物学活性进行初步分析。实验结果表明,重组ChIL-4在杆状病毒表达系统中获得成功表达,转染重组质粒Bac-ChIL-4的Sf9细胞中可见亮绿色荧光;将含有重组蛋白的Sf9细胞上清浓缩后进行间接ELISA检测,结果显示,抗ChIL-4的多抗血清仅识别重组ChIL-4;鸡脾脏淋巴细胞增殖实验结果表明,重组ChIL-4能够刺激鸡脾脏淋巴细胞的增殖,说明该重组蛋白具有较好的生物学活性。ChIL-4重组蛋白的获得为其进一步开发应用以及功能学研究提供了重要的生物材料。
研究资源与技术改进
紫云英实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择
Reference Gene Selection for Real-time Quantitative PCR Normalization in Astragalus sinicus
张贤 王建红 李增强 曹凯 庄俐 徐昌旭 曹卫东
2017, 25(8): 1356-1365  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (1746 KB)  ( 2 )
摘要
摘 要 在实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析中,选择合适的内参基因是保证检测结果准确性的先决条件。紫云英(Astragalus sinicus)基因组信息匮乏,内参基因的选择尤为重要。本研究筛选了7个持家基因GAPDH、Cons7、ELF1B、Tubulin、Ubiquitin E2、Actin A以及Actin 20,利用qRT-PCR 技术研究其的表达情况,并采用GeNorm、NormFinder和Best Keeper软件,分析其在紫云英不同组织(根、茎、叶、花和荚果)和不同非生物胁迫(干旱胁迫、涝胁迫、盐胁迫、脱落酸(abscisic acid, ABA)胁迫)条件下叶片中的表达稳定性。结果表明,7种内参基因在紫云英不同的组织器官和不同的胁迫处理分析中,稳定性表现不尽相同。Cons7 在盐胁迫和涝胁迫处理下最稳定,Tubulin、Actin 20和GAPDH分别在不同组织、ABA处理和干旱胁迫下表达最稳定。因此,采用qRT-PCR分析紫云英不同器官组织中的基因表达差异时,可选择Tubulin作为校正内参基因;而比较脱落酸处理、盐胁迫和涝胁迫处理时,可选择Cons7作为校正内参基因;比较干旱胁迫处理时,选择GAPDH作为校正内参基因。本研究结果为研究紫云英不同生理过程中目的基因表达提供了稳定可靠的内参基因。
粤黄鸡PGCs无饲养层培养体系的建立
Establishment of Feeder-free Culture System for PGCs of Yuehuang Chicken (Gallus gallus)
张晓芳 赵姝灿 张豫 郑桂纯 李京华 王丙云 陈志胜
2017, 25(8): 1366-1373  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (5627 KB)  ( 3 )
摘要
摘 要 原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)是生殖母细胞的前体细胞,作为一种多能干细胞,具有与胚胎干细胞相似的形态及分化潜能,能在体外进行培养、传代,并在一定条件下保持未分化状态及多能性。现阶段PGCs的体外培养体系中往往存在饲养层细胞和血清,为后期研究造成了困难和混淆。为建立粤黄鸡(Gallus gallus) PGCs的体外无饲养层培养体系。本研究通过改进培养体系成分分离纯化PGCs并进行体外培养。结果显示,所得无饲养层培养的PGCs直径为6~8 μm,生长曲线呈现“S”形,群体倍增时间(3.75±0.15) d,结果表明,PGCs具有良好的增殖生长状态;对分离纯化的PGCs特异性基因胚胎阶段特异性表面抗原(stage specific embryonic antigen-1, SSEA-1)和类无精症缺失基因(deleted in azoospermia-like, DAZL)进行免疫荧光鉴定,结果显示二者在PGCs均有表达,经化学免疫染色的细胞可观察到绿色的荧光;将无饲养层培养的PGCs用PKH26标记,注射到孵化至17~20 期受体鸡胚的背主动脉中,继续孵化至第5.5天,结果显示,分离纯化并通过PKH26标记的鸡胚血液PGCs仍然具有PGCs的特性,可随鸡胚的血液循环定殖于鸡胚性腺中。本研究优化了PGCs体外培养的条件,建立无饲养层无血清培养体系,为家禽PGCs应用于现代保种技术、转基因技术以及家禽的发育生物学等研究领域提供了重要的技术支持。
ORFV和Mo双重PCR检测方法的建立及应用
Establishment and Application of a Duplex PCR Assay for Detection of Orf virus (ORFV) and Mycoplasma ovipneumoniae (Mo)
林裕胜 江锦秀 江斌 游伟 胡奇林
2017, 25(8): 1374-1380  |  Full text (HTML) (1 KB)  | PDF   PDF  (1668 KB)  ( 3 )
摘要
摘 要 羊传染性脓疱病毒(Orf virus, ORFV)是羊传染性脓疱病(Contagious ecthyma, CE)的病原,绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Mo)是羊支原体性肺炎(Mycoplasma pneumonia of goats and sheep, MPGS)的主要病原,近年来此两种病原混合感染日益增多,目前采用单一PCR方法检测这两种病原,临床上迫切需要能同时快速检测这两种病原的方法。为了建立能够直接从样品中同时检测ORFV核酸和Mo核酸的双重PCR方法,本研究根据ORFV的主要膜蛋白B2L基因(major envelope protein B2L gene)和Mo的膜蛋白P80基因(membrane protein P80 gene)序列,设计合成了2对特异性引物。结果显示,该方法可以同时扩增出ORFV的402 bp和Mo的700 bp特异性片段,而对其他常见病原的DNA模板均无扩增,显示出良好的特异性,该方法对ORFV和Mo的最低检出量分别为1.1×103 copies/μL和3.47×103 copies/μL,比单一PCR敏感10倍。对来自福建省部分羊场的883份病山羊(Capra hircus)临床样品进行检测,双重PCR检出ORFV阳性样品28份(阳性率为33.7%),Mo阳性样品33份(阳性率为39.8%),同时感染ORFV和Mo的阳性样品9份(阳性率为10.8%),检测结果与单一ORFV和Mo PCR结果一致。本研究所建立的双重PCR方法可用于ORFV和Mo的临床检测,为CE和MPGS的临床快速鉴别诊断和流行病学调查提供了有效的方法。
 
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